Georg Edlinger & Sebastian Schwap 05.05.24 Georg Edlinger & Sebastian Schwap 05.05.24

Michaelis-Menten-Kinetik von Alpha-Amylase

α-Amylasen spalten Amylose (neben Amylopektin einem Bestandteil von Stärke), wodurch unter anderem Maltose entsteht. Durch Nachweis der Stärke mittels Lugol’scher Lösung und Quantifizierung über UV/VIS Spektroskopie lässt sich die Enzymkinetik bestimmen, wodurch die Michaelis-Menten-Parameter bestimmt werden können.

Allgemeine Hinweise zum Experimentieren und Disclaimer beachten!

Einleitung

Schwierigkeitsgrad

Schülerexperiment - schwer

Geräte

50 mL Becherglas (2 x), 100 mL Messkolben, Reagenzglas-Ständer, 15 mL Falcon Tubes, Mikroliterpipetten (5000 µL, 1000 µL & 10 µL), Stoppuhr, Magnetrührer mit Heizplatte und Rührfisch, Küvetten (Halbmikro), UV/VIS-Spektrometer, Mikrowelle, Analysenwaage, Computer mit MS Excel (oder anderweitiges Tabellenkalkulationsprogramm)

Chemikalien

lösliche Stärke
α-Amylase aus Bacillus amyloliquefaciens (> 250 U/g)
Lugol’sche Lösung

Durchführung

Zuerst wird eine 1 mg/mL Stärkelösung durch Einwiegen von 100 mg löslicher Stärke und Verdünnen auf 100 mL Wasser hergestellt. Die Stärke muss in der Siedehitze gelöst werden.

Zur Herstellung der Kalibriergeraden werden von dieser Stärkelösung 0, 100, 300 und 600 µL jeweils mit der entsprechenden Menge Wasser auf 1000 µL verdünnt und zur Gänze in eine Lösung aus 3 mL Wasser und einem Tropfen Iod-Kaliumiodidlösung überführt. Die Absorption bei 600 nm wird daraufhin zügig am UV/VIS-Spektrometer bestimmt.

Zur Reaktion werden 10 mL einer Stärkelösung mit einer Konzentration von 0,5, 0,75 und 1,0 mg/mL zusammen mit 1 µL einer verdünnten Amylase-Lösung angesetzt (10 µL Amylase auf 990 µL dest. Wasser). Nach 1, 3, 5, 10, 15, 30 und 45 min werden 1000 µL als Probe entnommen und wiederum in eine Lösung aus 1 Tropfen Iod-Kaliumiodid-Lösung in 3 mL dest. Wasser überführt. Die Absorption bei 600 nm wird daraufhin zügig am UV/VIS-Spektrometer bestimmt.

Das kann natürlich auch grafisch dargestellt werden:

Zur Datenauswertung werden die Absorptions/Zeit-Verläufe mittels der Kalibriergerade in Konzentrations/Zeit-Verläufe umgerechnet:

    Zeit [min] 
    Konzentration [mg/mL]
  


    
    1,00 mg/mL
    0,75 mg/mL
    0,50 mg/mL
  

    1
    0,621
    0,404
    0,293
  

    3
    0,511
    0,323
    0,238
  

    5
    0,406
    0,235
    0,179
  

    10
    0,291
    0,149
    0,114
  

    15
    0,212
    0,104
    0,090
  

    30
    0,141
    0,047
    0,059
  

    45
    0,105
    0,028
    0,047
  

Danach erfolgt die Bestimmung der Anfangsgeschwindigkeit durch lineare Regression anhand der ersten drei Messpunkte:

Die reziproken Werte der Anfangsgeschwindigkeit (Geradensteigung) werden mit den reziproken Werten der Anfangssubstratkonzentration in einer Lineweaver-Burk-Darstellung aufgetragen und daraus V_max und K_M bestimmt:

Es konnten 8.62 mg/mL als K_M Wert bestimmt werden, bei einer V_max von 0.52 mg/(mL*min).

Entsorgung

Alle Lösungen, die Iod bzw. Kaliumiodid enthalten, werden als halogenhaltige Salzlösung entsorgt.

Erklärung

Was versteht man unter der “Geschwindigkeit” einer chemischen Reaktion?

Zur Beantwortung dieser Frage wird die folgende Reaktion betrachtet, bei der ein Substrat (S) irreversibel zu einem Produkt (P) umgewandelt wird:

Die Geschwindigkeit der Reaktion würde dann als Änderung der Produktkonzentration (oder negative Änderung der Substratkonzentration) pro Zeiteinheit definiert werden:

Die Reaktionsgeschwindigkeit steht über einen Proportionalitätsfaktor - der Geschwindigkeitskonstante - in Zusammenhang mit der Substratkonzentration:

Hierbei handelt es sich um eine Reaktion 1. Ordnung, da die Geschwindigkeitskonstante in einem linearen Zusammenhang mit der Substratkonzentration steht. Auch andere Reaktionsordnungen sind möglich, beispielsweise ist bei einer Reaktion 0. Ordnung die Geschwindigkeit unabhängig von der Konzentration der Ausgangssubstanz.

Die Reaktionsgeschwindigkeit muss experimentell ermittelt werden, indem im Verlauf der Reaktion die Zunahme des Produkts (oder Abnahme des Edukts) beispielsweise über die Änderung der Absorption gemessen wird. Dabei zeigt sich, dass sich die Konzentration anfangs schnell ändert, sich aber irgendwann einer Gleichgewichtskonzentration annähert - die Reaktionsgeschwindigkeit ist also über den Reaktionsverlauf nicht konstant.

Um dennoch Aussagen über die Kinetik treffen zu können, wird die Anfangsgeschwindigkeit v₀ zum Zeitpunkt t ≈ 0 definiert. Da noch kaum Produkt gebildet wurde, ist die Rückreaktion vernachlässigbar klein.

Wird nun die Anfangsgeschwindigkeit von enzymatisch katalysierten Reaktionen bei unterschiedlichen Substratkonzentrationen gemessen, zeigt sich, dass die Anfangsgeschwindigkeit bei steigender Substratkonzentrationen anfangs linear zunimmt, bis sie sich irgendwann einer Maximalgeschwindigkeit v_max annähert:

Zur Beschreibung dieser kinetischen Eigenschaft schlugen Leonor Michealis und Maud Menten 1913 ein einfaches Modell vor. Hierbei formulierten sie einen Enzym-Substrat-Komplex, der als Zwischenprodukt auftreten muss:

Durch drei Annahmen kann das Modell vereinfacht werden:

Die Reaktion wird zum Zeitpunkt t ≈ 0 betrachtet, wodurch noch kein Produkt gebildet wurde und der Enzym-Substrat-Komplex irreversibel zum Produkt zerfällt
Die Konzentration des Enzym-Substrat-Komplexes ist konstant, dessen Bildung und Zerfall also gleich schnell (Steady-State)
Die Konzentration des Substrats ist deutlich höher als jene des Enzyms, die Konzentration an im Enzym gebundenem Substrat ist folglich gegenüber der Gesamtsubstratkonzentration vernachlässigbar.

Dadurch vereinfacht sich die Reaktionsgleichung zu folgendem Ausdruck und die Michealis-Menten-Gleichung lässt sich daraus ableiten (zur exakten Herleitung sei auf einschlägige Literatur verwiesen):

Diese Gleichung beschreibt den zuvor genannten Zusammenhang zwischen v₀ und v_max und der Substratkonzentration: Ist die Substratkonzentration kleiner als K_M, so steigt v₀ linear mit der Substratkonzentration, entsprechend einer Reaktion 1. Ordnung. Ist die Substratkonzentration aber (deutlich) größer als K_M, so geht die Reaktion über zu einer 0. Ordnung, bei der v₀ gleich v_max entspricht.

Die Michaelis-Menten-Konstante gibt folglich die Substratkonzentration an, bei der die Reaktionsgeschwindigkeit die Hälfte ihres Maximalwertes erreicht. K_M ist ein wichtiges Charakteristikum enzymatisch katalysierter Reaktionen und insbesondere für die biologische Funktion der Enzyme von Bedeutung.

Doch wie werden K_M und v_max nun bestimmt? Dazu wird die Michaelis-Menten-Gleichung zuerst auf ihre doppelt-reziproke Darstellung umgeformt, wodurch eine Geradengleichung erhalten wird:

Wird nun die experimentell ermittelte rezirpoke Anfangsgeschwindigkeit 1/v₀ über die bekannte reziproke Substratkonzentration 1/[S] in einem Lineweaver-Burk-Diagramm aufgetragen, so entspricht die Steigung der Geraden K_M/v_max, der x-Achsenabschnitt entspricht -1/K_M und der y-Achsenabschnitt entspricht 1/v_max.

Video

Literatur

Cochran et al. "Kinetic Analysis of Amylase Using Quantitative Benedict's and Iodine Starch Reagents" J. Chem. Educ. 85, 3 (2008): 401

Berg, Jeremy M., and John L. Tymoczko. Stryer biochemie. Vol. 8. Heidelberg: Springer Spektrum, 2018.

Gefährdungsbeurteilung (Gestis-Stoffdatenbank)

α-Amylase aus Bacillus amyloliquefaciens (> 250 U/g)
Lugol’sche Lösung
Lösliche Stärke (kein Gefahrstoff nach GHS)

DNA-Extraktion aus Bananen

Nicht nur in Filmen und TV-Serien werden Täter oft anhand einer DNA-Spur überführt. Doch wie viel DNA steckt eigentlich in jedem Kern unserer Zellen und wie extrahiert man diese am einfachsten? Ein einfacher Versuch am Beispiel einer Banane demonstriert dies eindrucksvoll.

Allgemeine Hinweise zum Experimentieren und Disclaimer beachten!

SCHWIERIGKEIT:

Schülerexperiment - einfach

GERÄTE

Becherglas 100mL, Erlenmeyerkolben 100mL, Mörser und Pistill, Glasspatel, Trichter, Filterpapier

CHEMIKALIEN

Ethanol

DURCHFÜHRUNG

Eine Lösung aus 5 mL Spülmittel, 45mL Wasser sowie einem halben Teelöffel Salz wird in einem 100 mL Becherglas bereitet. Zu dieser wird ca. ein ¼ einer Banane gegeben, welches zuvor in einem Mörser mittels Pistill zerdrückt wurde. Die zähflüssige Masse wird mit einem Glasspatel kräftig umgerührt und anschließend dieses Gemisch in den Erlenmeyerkolben filtriert.

Nun werden ca. 25 mL gekühlter Ethanol hinzugefügt. Schon nach kurzer Zeit bilden sich DNA-Polymere, die zur Oberfläche der Flüssigkeit aufsteigen.

ENTSORGUNG

Alle Feststoffe und anfallende Lösungen können im Restmüll bzw. dem Ausguss entsorgt werden.

ERKLÄRUNG

Beim Zerdrücken der Banane im Mörser werden die Zellen auseinandergerissen, die Zellwände teilweise zerstört und das Innere der Zelle freigesetzt. Durch das Hinzufügen des Spülmittels werden auch die restlichen Zellwände und die Zellmembran aufgelöst und die DNA freigelegt. Dies geschieht da Spülmittel ein Detergenz – ein Stoff der Fette in Lösung bringt – ist und somit die aus Fetten bestehenden Zellwände und Zellmembranen lösen kann.

Durch die Polarität von Wasser löst dieses die negativ geladene DNA, wobei der Effekt durch die Tatsache, dass die Salzkonzentration der Lösung ungefähr der im lebenden Organismus entspricht verstärkt wird.

Der abschließend hinzugegebene Ethanol entfernt die Hydrathülle der DNA und verringert die Löslichkeit dieser - die DNA beginnt auszufallen und zu polymerisieren.

FOTOS

VIDEO

LITERATUR

GEFÄHRDUNGSBEURTEILUNG (GESTIS-STOFFDATENBANK)

Ethanol

Gramfärbung

Die Gram Färbung – entwickelt vom dänischen Bakteriologen Hans Christian Gram ermöglicht es, Bakterien anhand von Unterschieden im Aufbau der Zellwände zu unterscheiden. Aufgrund der Einfachheit und kurzen Zeitdauer bis zu einem Ergebnis ist die Gram Färbung auch heute noch ein wichtiges Mittel in der Diagnostik bakterieller Infektionskrankheiten.

Allgemeine Hinweise zum Experimentieren und Disclaimer beachten!

Die Gramfärbung – entwickelt vom dänischen Bakteriologen Hans Christian Gram - ermöglicht es, Bakterien anhand von Unterschieden im Aufbau der Zellwände zu unterscheiden. Aufgrund der Einfachheit und kurzen Zeitdauer bis zu einem Ergebnis ist die Gramfärbung auch heute noch ein wichtiges Mittel in der Diagnostik bakterieller Infektionskrankheiten.